RNF20依存的なH2Bのユビキチン化による相同組換え修復の制御

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　DNA損傷に起因するヒストンH2AXのリン酸化、ユビキチン化などの修飾はDNA修復において非常に重要である。これらの修飾はDNA二重鎖切断（Double Strand Break: DSB）後に数分の間に起こり、相同組換え修復（Homologous Recombination Repair: HRR）関連因子の損傷部位への集積に機能する。しかしながら、H2AX-/-細胞でもHRRの経路が完全には破綻していないことや、その経路で中心的な機能を担うRAD51のDNA損傷部位への局在は正常であることからH2AX以外のHRR経路の存在が示唆される。DNA損傷に起因するヒストンH2AXのリン酸化、ユビキチン化などの修飾はDNA修復において非常に重要である。これらの修飾はDNA二重鎖切断（Double Strand Break: DSB）後に数分の間に起こり、相同組換え修復（Homologous Recombination Repair: HRR）関連因子の損傷部位への集積に機能する。しかしながら、H2AX-/-細胞でもHRRの経路が完全には破綻していないことや、その経路で中心的な機能を担うRAD51のDNA損傷部位への局在は正常であることからH2AX以外のHRR経路の存在が示唆される。

　我々は、HRRに必須の因子であるNBS1に結合するタンパク質としてRNF20 (Ring finger protein 20)を同定した。ユビキチンE3リガーゼであるRNF20は、転写の際、ヒストンH2Bをモノユビキチン化することにより、RNA polIIが関与するmRNAの伸長反応を促進することが知られている。また酵母では、RNF20のホモログであるBre1がRAD51と同じ経路でHRRに関与するという報告がある。今回我々は、電離放射線（IR）照射によるDNA損傷の修復経路においてもRNF20依存的にH2Bがモノユビキチン化されることを発見し、その修飾がH2AXとは独立してHRR経路に機能することを明らかにした。
　初めに、DNA損傷応答にRNF20が関与するかどうかを検証するために、RNF20の局在とその標的であるH2Bのモノユビキチン化を解析した。IR照射後、RNF20は他のDNA修復関連因子に見られるように核内フォーカスを形成し、H2Bのモノユビキチン化はRNF20依存的に増加した。次にDNA損傷修復経路におけるRNF20の機能を解析するためにsiRNAを用いてRNF20をノックダウンしたところ、RNF20ノックダウン細胞では、RAD51,BRCA1の核内フォーカスが抑制され、またこの結果と一致するように放射線、マイトマイシンCに対し感受性を示した。この結果がH2Bのモノユビキチン化を介しているのかどうかを確認するためにH2Bのモノユビキチン化部位の変異体（H2B-K120R）を作製し、野生型細胞に強制発現させた。その結果、H2B-K120Rを発現させた細胞でのみRNF20ノックダウン細胞と同じ表現型が得られた。これらの結果からRNF20は、DNA損傷部位でH2Bをモノユビキチン化することによりRAD51,BRCA1の局在を制御していると考えられる。また、転写阻害剤であるactinomycin D、DRBで処理した細胞ではDNA修復経路の異常は検出されず、IR照射後のH2Bのモノユビキチン化も確認されたことから、RNF20が転写を活性化する機能とは別に、直接的にDNA修復に関与していることが明らかとなった。
　RNF20はRAD51,BRCA1の局在を制御していることから、RNF20もまたHRRに機能することが示唆される。そこでHRR頻度をSCneoアッセイにより解析したところ、RNF20ノックダウン細胞、H2B-K120R強制発現細胞はそれぞれHRRの低下を示した。さらにRNF20をノックダウンした細胞にさらにH2B-K120Rを強制発現させても相加的なHRRの低下が見られないことから、やはりRNF20とH2Bのモノユビキチン化は同経路でHRRに機能していると考えられる。HRR解析に関連して、一本鎖DNAに結合するRPAフォーカスの軽時的な変化を観察することにより、DNA resectionの効率を解析した。RNF20ノックダウン細胞ではRPAフォーカスが減少し、CtIPとのダブルノックダウン細胞ではCtIP単独のノックダウン細胞と同様なRPAフォーカス形成効率を示した。これらの結果により、RNF20はHRRにおけるCtIP依存的なDNA resectionに機能していると考えられる。これはRNF20をノックダウンした細胞では、IR照射後のCtIP,RAD51,BRCA1,RPAのクロマチン画分への蓄積が減少する結果と合致する。
　次に、H2Bのモノユビキチン化とH2AXとの関係をそれぞれのノックダウンにより検証した。H2AXをノックダウンした細胞ではH2Bは正常にモノユビキチン化され、反対にRNF20のノックダウンでもH2AXのリン酸化、ユビキチン化に影響は無かった。この結果から、H2Bのモノユビキチン化の経路は、H2AXの経路とは独立してHRRに機能していると考えられる。またこの結果は、RNF20とH2AXを同時にノックダウンした細胞では、それぞれ単独のノックダウンよりもHRR頻度が低下し、IRに対して相加的に感受性を示す結果と一致する。 　転写におけるH2Bのモノユビキチン化の機能はクロマチンリモデリングであることから、DNA修復においても同様の機能を果たすかどうかを解析した。RNF20をノックダウンした細胞でもクロロキンやトリコスタチンAなどの薬剤により強制的にクロマチンリモデリングを誘発すればRAD51、BRCA1のフォーカス形成が相補されることから、RNF20はH2Bのモノユビキチン化を介するクロマチンリモデリングを制御することにより修復関連タンパク質を損傷部位に集積させる働きがあることが示唆された。そこでH2Bのモノユビキチン化とクロマチンリモデリングの関係を明らかにするために、転写時H2Bのモノユビキチン化に続いて起こるヒストンH3の４番目のリジン（H3K4）のメチル化がDNA修復に関与するかどうかをクロマチン免疫沈降法 (ChIP)を用いて調べた。その結果、RNF20依存的にDSB部位のH3K4がメチル化されること、さらにそのメチル化に結合するクロマチンリモデリング因子SNF2hもRNF20が機能している細胞でのみDSB部位に集積してくることが確認された。SNF2hをノックダウンした細胞ではRNF20のノックダウン細胞と同様にRAD51、BRCA1のフォーカス形成の低下が見られ、エピスタシス解析によりRNF20と同経路でHRRに機能することが明らかとなった。
　以上の結果より、RNF20はDSBが起こると1、損傷部位近傍のH2Bをモノユビキチン化する。　２、H3K4のメチル化を促進し、SNF2hを損傷部位にリクルートする。３、SNF2hによりDSB部位周辺のクロマチンリモデリングが起こる４、RAD51等の修復因子の集積を促進する。という、既知のH2AX経路とは異なる新たなDNA修復経路のモデルを提唱した。